Описание

Метод исследования: Нанопоровое секвенирование

Исследуемый образец: Образец микробиоты кишечника в фиксирующем растворе

Можно вызвать курьера

Краткое описание

Последовательность 16S рРНК представлена девятью гипервариабельными участками и разделяющими их консервативными последовательностями. Благодаря этим особенностям первичной структуры ген 16S рРНК используют для филогенетических исследований. Характеристики исследования:

• определение состава биологического образца на содержание бактерий и архей
• секвенирование гена 16s, регион v3/v4
• исследование включает выделение ДНК, пробоподготовку (амплификация 16S-генов, баркодирование), нанопоровое секвенирование, биоинформатический анализ (определение рода микроорганизмов)
• нанопоровое секвенирование с использованием MinION Oxford Nanopore

У всех организмов найдено три вида рРНК, отличающиеся по молекулярным массам и локализации в рибосомах, обязательной составной частью которых они являются.

Первичная структура рРНК

Различают (цифры в названии рРНК равны значению константы седиментации) (K. Fukuda et. al., 2016):

• 16–18S рРНК, локализована в 30–40S субъединицах рибосом (Мr = 0.55–0.79·106);
• 23–29S рРНК, локализована в 50–60S субъединицах рибосом (Мr = 1.07–1.6·106);
• 5S рРНК присутствует во всех рибосомах и локализована в 50–60S субъединицах (Мr = 40 тыс.);
• 5.8S рРНК характерна только для эукариотических рибосом (Мr около 50 тыс.).

Изучены последовательности 16S рРНК и 18S рРНК для более чем 400 видов из различных царств живой природы. Ген 16S рРНК главным образом используется в исследовании бактерий и архей, 18S – грибов. Первичная структура 16S рРНК представлена одноцепочечной последовательностью, состоящей из 1600 рибонуклеотидов. На протяжении всей последовательности равномерно расположены консервативные для многих видов и гипервариабельные участки (P. Yarza et. al., 2014; M. Makedonka, 2017).

Ген 16S рРНК содержит девять гипервариабельных участков, обозначаемых V1 – V9, длиной от 30 до 100 пар оснований. Эти участки вовлечены в образование вторичной структуры малой субъединицы рибосомы. Между гипервариабельными расположены консервативные последовательности.

Вторичная структура рРНК

Вторичная структура 16S рРНК представлена на (рисунке) (Y Van de Peer et. al., 1996), где буквами показаны консервативные нуклеотиды для всех прокариот, звёздочками – нуклеотиды, консервативные для бактерий или архей, все остальные – точками. Domain I соответствует 5′-концевому домену, Domain II – центральному, Domain III – большому 3′-концевому домену, Domain IV – малому 3′-концевому домену.

Во вторичной структуре 16S рРНК можно выделить 4 хорошо различимых домена (подобно домену белка, домен РНК является стабильной, самостоятельно собирающейся структурой молекулы): 5′-домен (остатки 1–556), центральный (остатки 564–912) и два домена на 3′-конце (большой домен 926–1391 и малый домен 1392–1542). Различные домены отделены друг от друга с помощью спиралей, которые на конце имеют РНК-шпильки. Также вторичная структура 16S рРНК содержит 5′- и 3′-неспаренные основания, которые образуют петли. Предполагается, что эти основания могут участвовать в формировании третичной структуры 16S рРНК, соединяясь с помощью водородных связей не по каноническому Уотсон-Криковскому связыванию оснований (H. F. Noller et. al., 1981).

Функции 16S РНК

Для 16S рРНК описаны следующие функции:

• как и 23S рРНК, 16S рРНК играет структурную роль, выступая в качестве каркаса, определяющего положение рибосомальных белков;
• 3′-конец содержит последовательность анти-Шайна-Дальгарно, с помощью которой 16S рРНК связывается с мРНК;
• 3′-конец связывается с факторами, участвующими в инициации трансляции (S1 и S21) (A. P. Czernilofsky et. al., 1975);
• 16S рРНК взаимодействует с 23S рРНК, способствуя связыванию большой и малой рибосомальных субъединиц (50S и 30S);
• стабилизирует правильное спаривание кодона и антикодона в А-сайте большой субъединицы рибосомы, посредством образования водородной связи между атомом азота (N1) 1492 или 1493 остатка аденина и группой 2’OH основной цепи мРНК (H. F. Noller et. al., 1981).

Применение 16S рРНК

Филогенетические исследования

Последовательность 16S рРНК представлена девятью гипервариабельными участками и разделяющими их консервативными последовательностями. Благодаря этим особенностям первичной структуры ген 16S рРНК используют для филогенетических исследований. Наличие высоко консервативных участков позволяет создавать универсальные праймеры, которые можно применять для исследования бактерий и архей, вне зависимости от их таксономической принадлежности (W. G. Weisburg et. al., 1991). Выбранная область отжига праймеров настолько консервативна, что универсальные праймеры можно использовать для амплификации 16S рРНК митохондрий и хлоропластов – потомков альфа-протеобактерий и цианобактерий, соответственно (J. J. Zackary et. al., 2015).

Методы секвенирования с универсальными праймерами применяются в медицинской микробиологии как быстрая и дешёвая альтернатива морфологическому способу идентификации бактерий, который требует большого числа манипуляций, в том числе нередко необходимо продолжительное время культивировать потенциальных патогенов в лабораторных условиях. Кроме того, секвенирование даёт более надёжные результаты (J. E. Clarridge et. al., 2004). В этой отрасли применяются определённые гипервариабельные участки: например, участок V3 лучше всего показывает себя при идентификации родов патогенов, а V6 для идентификации видов (S. Chakravorty et. al., 2007). В таких исследованиях с особой тщательностью подходят к выбору праймеров и амплифицируемого фрагмента. Основными критериями являются полный охват исследуемых организмов (в данном случае это археи и бактерии) и филогенетическая разрешающая способность последовательности, то есть то, насколько детально возможно определить таксономическую принадлежность организма по последовательности (A. E. Parada et. al., 2007; J. G. Caporaso et. al., 2007; B. Yang et. al., 2016; J. P. Gray et. al., 1996; P. J. Brett et. al., 1998).

С появлением секвенирования третьего поколения во многих лабораториях стала возможна одновременная идентификация тысяч последовательностей 16S рРНК в течение нескольких часов, что позволяет проводить метагеномные исследования, например исследования микрофлоры кишечника (S. Sanschagrin et. al., 2014).

Ограничения использования гена 16S рРНК для филогенетических исследований

Гипервариабельные участки почти не справляются с распознаванием близкородственных видов. Например, последовательности гена 16S рРНК у представителей семейств Enterobacteriaceae, Clostridiaceae и Peptostreptococcaceae схожи на 99 %. То есть гипервариабельный участок V4 может различаться всего на несколько нуклеотидов, что делает невозможным достоверное различие таксонов бактерий низкого ранга. Если ограничивать исследование таксономии бактерий анализом гипервариабельных участков 16S рРНК, можно ошибочно объединить близкородственные группы в один таксон и недооценить разнообразие исследуемой группы бактерий (T. Větrovský et. al., 2013; J. Jovel et. al., 2016).

Более того, бактериальный геном может содержать несколько генов 16S рРНК, гипервариабельные участки V1, V2 и V6 которых представляют наибольшее внутривидовое разнообразие. Будучи не самым точным методом классификации видов бактерий, анализ гипервариабельных участков остаётся одним из самых используемых методов, применимым к исследованию бактериальных сообществ (T. Coenye et. al., 2003).

В свете допущения, что эволюцией движет вертикальный перенос генетического материала от предков к потомкам, гены 16S рРНК долгое время считались видоспецифичными и оттого весьма точными маркерами для определения родства между группами прокариот. Однако возрастающее число наблюдений позволяют предположить возможность горизонтального переноса этих генов. В дополнение к наблюдениям горизонтального переноса генов в природе были представлены экспериментальные доказательства этих событий. В исследовании использовался мутантный штамм Escherichia coli, лишённый собственного гена 16S рРНК. Однако наблюдалась сборка функциональной рибосомы с использованием 16S рРНК, заимствованной от неродственной E. coli бактерии (K. Kitahara et. al., 2012; M. Tsukuda et. al., 2017). Подобная функциональная совместимость также наблюдалась у Thermus thermophilus. Более того, у T. thermophilus наблюдался как полный, так и частичный перенос гена. Частичный перенос выражался в спонтанном образовании, по-видимому, случайной химерной последовательности между геном бактерии-хозяина и чужеродным геном (B. A. Smith et. al., 2018).

Итак, ген 16S рРНК мог эволюционировать несколькими путями, включая вертикальный и горизонтальный перенос генов. Частота последнего варианта может быть значительно выше, чем считалось ранее.

Базы данных 16S рРНК

Последовательности генов 16S рРНК определены для типовых штаммов бактерий и архей и собраны в открытые базы данных, таких как NCBI. Тем не менее, качество отсеквенированных последовательностей, содержащихся в подобных базах данных, часто не проверяется. В результате этого широко используются вторичные базы данных, содержащие только последовательности генов 16S рРНК (S.-Ch. Park et. al., 2018). Наиболее часто используемые базы данных перечислены ниже.

EzBioCloud

База данных EzBioCloud, ранее известная как EzTaxon, состоит из полной иерархической таксономической системы, содержащей 65 342 последовательности 16S рРНК бактерий и архей на февраль 2020. База данных EzBioCloud систематически курируется и регулярно обновляется. Кроме того, веб-сайт базы данных предоставляет биоинформатические инструменты, такие как калькулятор ANI, для выявления процента сходства двух последовательностей прокариотических геномов, инструмент для парного выравнивания двух последовательностей и многие другие (S.-H. Yoon et. al., 2017).

Ribosomal Database Project (RDP)

RDP — это курируемая база данных, предоставляющая информацию по последовательностям рРНК и сопутствующие программы и сервисы. Предлагаемый контент включает сгруппированные на основе филогении выравнивания рРНК, полученные на основе выравниваний филогенетические деревья, вторичные структуры рРНК и различные программы для визуализации и анализа информации для исследований генов рРНК. Большинство пакетов программ доступно для скачивания и локального использования (J. R. Cole et. al., 2014).

SILVA

SILVA является базой данных, содержащей проверяемый вручную и регулярно обновляемый набор выравниваний последовательностей рРНК малых субъединиц рибосом (16S/18S) и больших субъединиц рибосом (23S/28S), относящимся ко всем трём доменам жизни. Также на основе базы данных создан сервис для дизайна праймеров и построения филогенетических выравниваний (E. Pruesse et. al., 2007).