Описание

Компания ООО "Омнином" осуществляет разработку Платформы для исследования и комплексного анализа молекулярно-генетических данных индивида с использованием алгоритмов искусственного интеллекта с целью помощи принятия решений в области здоровьесбережения

Проект финансируется Фондом содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере (фонд Бортника).

Неоднородность человеческой популяции сказывается на эффективности разрабатываемых препаратов, методов терапии, особенно индивидуальных, особенностях питания, занятиями спортом и пр. Организм человека – сложная система, основанная на комплексе равновесных превращений веществ, регулируемых ферментами (рис.). Активность ферментов на 90% определяется генетически (но также зависит от наличия в организме так называемых коферментов – витаминов и некоторых других соединений, поступающих извне, в большинстве случаем – с питанием). Исследуя гены (точечные мутации), можно оценить потенциальные особенности фенотипа организма и риски для здоровья. На этом основании можно разрабатывать рекомендации по образу жизни (предпочтительные виды физической активности, диеты, частота и виды медицинских обследований и пр.). Данный вид исследований широко представлен на рынке различными компаниями и не является уникальным (таблица).

Таблица – Компании, предоставляющие на рынке России, услуги по исследованию и рекомендации по здоровому образу жизни на основании генетики

В таблице приведены успешные примеры компаний, оказывающих услуги генетического тестирования населению, отмечены некоторые особенности, включая недостатки.

Большинство генов эукариот состоят из экзонов (части ДНК, кодирующие белки и пептиды) и интронов (некодирующие части). В процессе транскрипции с ДНК образуется пре-мРНК (РНК, содержащая экзоны и интрона). Далее в процессе сплайсинга интроны вырезаются, а экзоны сшиваются, образуя зрелую мРНК. В процессе трансляции на рибосомах по зрелой мРНК синтезируется белок. Однако, трансляция может быть замедлена (или вовсе остановлена) при участии миРНК (рисунок).

Рисунок – Общая схема процесса регуляции генной активности в клетках.

Рисунок – Общая схема равновесных превращений веществ в клетках, регулируемых ферментами: вещества (В1-В4) превращаются друг в друга в химических реакциях; смещение равновесия (толщина стрелок) определяется концентрацией веществ (диаметр окружностей В1-В4) и активностью ферментов (Ф1-Ф4); активность и количество ферментов в клетке зависят от активности генов (Ген1-Ген4) и наличия коферментов (КФ1-КФ4); коферменты – витамины, микроэлементы и другие соединения – поступают извне с питанием или синтезируются организмом; активность генов регулируют миРНК (миРНК1-миРНК5).

Последовательности молекул миРНК также закодированы в геноме (в интронах того же гена, или – в других генах). Пре-миРНК образуются в процессе транскрипции, выходят из ядра, вызревают и, взаимодействуя со зрелой мРНК, либо замедляют транскрипцию, либо полностью её останавливают – зависит от комплиментарности миРНК и мРНК. Данные молекулы могут секретироваться клетками в кровоток, мигрировать из одного органа в другой, осуществляя регуляцию молекулярных превращений на уровне всего организма. Для органов характерны собственные паттерны миРНК, которые реагирует на внешние воздействия и внутренние изменения, отражая актуальные процессы в клетках.

Исследуя миРНК и метаболиты в сыворотке крови (или слюне ) можно осуществлять оценку актуального состояния человека, анализировать активность генов, разрабатывать более точные рекомендации, сочетая анализ ДНК, миРНК и метаболиты.

Данная разработка является уникальной, поскольку предполагает одновременный анализ генетических (врождённых) особенностей человека, а также миРНК и метаболитов. Подобные исследования отсутствует на российском и мировом рынках.

В качестве примера попытки интеграции данных разного уровня в единую систему интерпретации можно рассмотреть исследование микробиоты компании Атлас. В данном тесте осуществляется исследование состава микробиоты кишечника человека по 16s-РНК с рекомендуемой периодичностью в 2-3 месяца, выдаются рекомендации по диете. Однако, компания анализирует данные (генетики и микробиоты) по-отдельности, что является существенным недостатком исследования.

Результатом реализации разрабатываемой услуги в данном проекте будет комплексный анализ: ДНК, миРНК и метаболитов. Совокупный анализ данных и разработка рекомендаций будет осуществляться с использованием искусственного интеллекта.

Кроме того, уникальность разрабатываемой услуги – в технологиях исследования ДНК и миРНК методом нанопорового секвенирования, а также исследования метаболома методом ЯМР.

Идентификация и количественная оценка миРНК являются сложной задачей из-за их короткой длины, высокого сходства последовательностей, существования изоформ и O-метил-3'-модификаций [93].

Золотым стандартом исследования миРНК является полимеразная цепная реакция в реальном времени с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР в РВ) [94]. Известны другие методы исследования миРНК: анализ миРНК на чипах nCounter Nanostring [95], Agilent или Affymetrix [93], или секвенирование нового поколения (miRNA-seq NGS) [93][94]. Преимуществом данных подходов является возможность определения большого количества мишеней в биологическом образце одновременно; недостатком – длительная пробоподготовка и высокая стоимость (в среднем – до 40 тыс. руб./ образец, с учётом текущей ситуации с импортом – прогнозируемая стоимость достигнет 80 тыс. руб./ образец). При этом при использовании NGS возможно проводить скрининговые исследования миРНК (на чипах возможно определять лишь заранее заданные маркеры).

Показаны различия в результатах количественной оценки миРНК, полученных на различных платформах (Agilent, Affymetrix и Illumina) [93]. Также отмечается, что при использовании NGS получаются наиболее точные результаты (по сравнению с ПЦР или чипами), включая анализ образцов, фиксированных в формалине и парафине (наиболее распространённые образцы в онкологии) [94].

Общим недостатком метода ПЦР и исследований на чипах является их ограниченность заранее заданными маркерами. При этом технология ПЦР (одна реакция – один маркер в одном образце) при масштабировании значительно удорожает исследование при большом потоке образцов. Для исследований на чипах и miRNA-seq, напротив, необходим процессинг большого количества образцов одновременно. Рыночная стоимость одного образца с использованием технологий RNA-seq или исследований на чипах (Agilent, Affymetrix или Nanostring) в России составляет порядка 40 тыс. руб., что существенно сужает рыночный потенциал метода (с учётом текущей ситуации с импортном прогнозируемая стоимость при наличии реактивов составит порядка 80 тыс. руб.).

В данном проекте на I этапе будет разработан новый подход к исследованию миРНК – секвенирование с использованием технологии Oxford Nanopore, который позволит снизить стоимость исследования до 10 тыс. руб. и ниже (учтена возможность использования российских расходных материалов, см. раздел 2.3 – Методы и способы решения поставленных задач для получения ожидаемых характеристик). Аналогичная технология будет использована для исследования ДНК. Таким образом, для анализа ДНК и миРНК будет использована единая технология, что позволит существенно сократить издержки исследования. Кроме того, в данном проекте будет разработана возможность использования альтернативной технологии – секвенирование на коротких ридах с применением российского секвенатора (ООО «Синтол»).

Исследование метаболома будет осуществляться методом ЯМР. Для интерпретации результатов на II этапе проекта будет разработан специальный алгоритм для расчёта концентраций.

Следует отметить, что разрабатываемая Платформа и подход к интерпретации молекулярных данных индивида, позволят использовать другие результаты исследований, например, метагеномные исследования микробиоты кишечника, результаты которых также будут интегрированы в общую систему интерпретации на следующих этапах развития проекта.

Для разработки индивидуальных рекомендаций по здоровому образу жизни на основании «omics» -данных индивида используются следующие типы данных: генетика, миРНК, метаболом. На текущем этапе проекта мы разработали технологию исследования миРНК в слюне.

Технологический процесс включает следующие этапы (рисунок):

• консервация миРНК в слюне для последующей транспортировки в лабораторию;
• выделение миРНК из слюны с использованием магнитных частиц или колонок;
• создание библиотек кДНК;
• секвенирование;
• биоинформатическая обработка результатов.

Рисунок – Принципиальная схема работы с образцов биоматериала.

Стабилизация внеклеточных нуклеиновых кислот – важный этап при работе с биологическими образцами, содержащими нуклеиновые кислоты. Проблемы, связанные с выделением внеклеточных нуклеиновых кислот, включают трудоемкость традиционных протоколов выделения, а также необходимость немедленной обработки образцов биологического материала во избежание лизиса клеток. Для исследования важно отделить внеклеточную фракцию нуклеиновых кислот от клеток, которые имеют тенденцию к разрушению в процессе хранения биологического материала – сохранить клетки неразрушенными в процессе транспортировки в лабораторию. Часто образцы крови обрабатывают непосредственно после забора для удаления всех клеток, а полученную плазму замораживают. Однако этот процесс длительный, а лизис клеток часто начинается до того, как клетки будут удалены. Более того, даже при отделении плазмы непосредственно в месте отбора крови в образце сохраняются остаточные количества клеток.

Для стабилизации клеточных мембран используют формальдегид (снижает лизис клеток, ингибирует нуклеазы), что приводит к увеличение выхода свободноциркулирующих нуклеиновых кислот [1] в плазме крови, обработанной в течение 36 часов после забора [2–4], но не в течение 6 часов [2]. Недостаток способа – индукция образования поперечных связей между нуклеиновыми кислотами и белками, что затрудняет последующее выделение нуклеиновых кислот. Кроме того, формальдегид обладает токсичностью, что затрудняет его использование в качестве консервирующего агента.

В данной работе мы разработали метод консервации миРНК в слюне с использованием рецептуры, включающей: а) ингибитор каспаз, б) гипертонический агент (для стабилизации клеток), в) дополнительные стабилизаторы из ряда аминов, г) антикоагулянт, д) полимер. Стабилизирующий эффект сравнивали с PAXgene Blood DNA tube (Германия) и Streck Cell-Free DNA BCT (США). Показан улучшенный стабилизирующий эффект по сравнению с указанными прототипами.

В настоящий момент мы осуществляет обеспечение правовой защиты результатов и организацию производства. Скоро разработка в виде готового продукта будет доступна в продаже.

1. Dhallan R. et al. Methods to Increase the Percentage of Free Fetal DNA Recovered From the Maternal Circulation // JAMA. 2004. Vol. 291, № 9. P. 1114.
2. Zhang Y. et al. Effect of formaldehyde treatment on the recovery of cell-free fetal DNA from maternal plasma at different processing times // Clin. Chim. Acta. 2008. Vol. 397, № 1–2. P. 60–64.
3. Dhallan R.S. Methods for detection of genetic disorders: pat. US7332277B2 USA. USA, 2003.
4. Dhallan R.S. Methods for detection of genetic disorders: pat. US7442506B2 USA. USA, 2005.